503

Rezumat

  Obiective
Studiul de faţa īşi propune să analizeze comparativ compozitia chimică a două extracte vegetale provenite de la specia Tamarix ramosissima și Vaccinium myrtillus, prin diferite tehnici fizico-chimice de analiză: gc-ms, hplc, tlc, analiza capacităţii antioxidante a tincturilor prin determinarea totalului polifenolic şi a totalului flavonoidic. Se urmărește testarea potentialul terapeutic antioxidant al speciei Tamarix ramosissima, utilizānd șoareci cu diabet indus experimental cu streptozotocină, comparativ cu specia Vaccinium myrtillus (produs cu potenţial antioxidant recunoscut). De asemenea un alt obiectiv este realizarea unei corelări īntre conținutul polifenolic al extractelor vegetale și eficacitatea terapeutică. Scopul principal al cercetării este ca rezultatele obținute să fie publicate īntr-o revistă cotată ISI Thomson cu factor de impact.

Material și metodă

Protocol de inducere a diabetului zaharat
Pentru inducerea diabetului zaharat se vor utiliza şoareci rasa Swiss albino, sănătoşi, masculi, cu greutate și vārstă apropiată. Experimentul va urmări standardele prezente īn ghidurile de īngrijire şi utilizare a animalelor īn modele experimentale. Distrucția celulelor pancreatice se va realiza prin injectarea streptozotocinei īn doză unică de 180 mg/kg, intraperitoneal, cantităţile injectate fiind determinate īn conformitate cu greutatea corporală a animalului. Distrugerea celulelor pancreatice de către streptozotocină este asociată cu o eliberare mare de insulină, putānd provoca hipoglicemie severă, care poate fi letală. Astfel, după administrarea streptozotocinei animalele vor avea acces la o soluție de glucoză (5%) timp de 24 h, pentru a evita hipoglicemia. Greutatea şoarecilor şi glicemia vor fi monitorizate īnaintea injectării streptozotocinei, apoi după 72 de ore şi la o săptămānă, animalele fiind menţinute la post alimentar cu 12 ore īnaintea recoltărilor probelor de sānge pentru determinările biochimice. Animalele cu valori ale glicemiei ą jeun peste 300 mg/dl, confirmate prin două determinări (la 3 zile şi la o săptamānă după injectarea streptozotocinei) sunt considerate diabetice şi vor fi introduse īn loturile de cercetare. Glicemia şoarecilor va fi fost măsurată cu ajutorul unui glucometru, prelevānd sānge din vena de la nivelul cozii.

Designul exterimental de testare a activității antioxidante
Experimentul farmacodinamic se va efectua pe cinci loturi de şoareci adulţi Swiss Albino, fiecare lot fiind compus din cinci rozătoare. Animalele vor primi zilnic, la aceeaşi oră, timp de cinci săptămāni extractul vegetal de testat. Loturile vor fi constituite astfel˸

Lot 1 - şoareci cu funcţie pancreatică normală (lot martor sănătos), nu va primi tratament.
Lot 2 - șoareci diabetici netratați (lot martor diabetic), nu va primi tratament.
Lot 3 - șoareci diabetici tratați cu extract din Tamaricis ramosissimae folium et flos 20%, 150 mg/kg corp.
Lot 4 ˗ șoareci diabetici tratați cu extract din Myrtilli fructus 20%, 150 mg/kg corp.

După cele cinci săptămāni de testare, animalele vor fi sacrificate, vom recolta probe de sānge īn tuburi heparinizate, fiind prelucrate pentru separarea plasmei și hemoliza eritrocitelor. Investigaţiile biochimice efectuate se vor adresa determinării nivelului peroxizilor lipidici și activității superoxid dismutazei (SOD), glutation peroxidazei (GPx) și glutation reductazei (GR).
Hemoliza hematiilor: 0,5 ml sānge total centrifugat 10 min. la 3000 rpm, plasmă aspirată, celulele spălate de patru ori cu soluție fiziologică şi centrifugate. Hemoliza produsă cu 2ml apă bidistilată rece, repaus 15 min. la 4° C. Diluarea lizatului cu tampon fosfat 0,01 M, pH 7 și utilizate pentru evaluarea activităților enzimelor antioxidante.
Evaluarea activității superoxid dismutazei (SOD). Activitatea SOD eritrocitar se măsoară prin rata de inhibare a oxidării 2-(4-iodofenil)-3(4-nitrofenol)-5-feniltetrazoliu (INT) de superoxidul format īn reacția xantin oxidazei.
Evaluarea activității glutation peroxidazei (GPX). Activitatea GPX eritrocitar se determină din variația absorbţiei la 340 nm după oxidarea GSH de către hidroperoxidul de cumen și reducerii GSSG cu GR și NADPH, H +.
Evaluarea activității glutation reductazei (GR). Activitatea GR se măsoară din scăderea absorbţiei la 340 nm după oxidarea NADPH, H + odată cu reducerea GSSG la GSH.
Evaluarea peroxizilor lipidici (POL). Malondialdehida, principalul produs al peroxidării lipidice, reacţionează cu acidul tiobarbituric 20% formānd un compus care absoarbe la 532 nm.

Analiza histologică
Analiza histologică a țesuturilor va fi realizată pentru a observa corelația īntre efectele antioxidante ale extractelor vegetale şi potențialul reparator tisular asupra organelor.
Pancreasul animalelor va fi prelevat şi prelucrat conform protocolului, realizāndu-se frotiuri colorate cu hematoxilină–eozină ce vor fi analizate apoi la microscopul optic.

Evaluare statistică
Datele vor fi evaluate statistic cu ajutorul t-test Two Sample, utilizānd funcția Excel din pachetul Microsoft Office. Diferenţele īntre valorile parametrilor măsurați vor fi interpretate ca fiind semnificative statistic dacă nivelul de semnificație p < 0,05.

Considerente etice
Protocolul cercetării pe animale,va fi supus aprobării de către Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie, Craiova, pentru ca experimentul să se desfăşoare īn acord cu standardele prezente īn ghidurile de īngrijire şi utilizare a animalelor īn modele experimentale.