Laboratorul de Studii Genetice în Cancer



Departamentul de Genetică Moleculară din cadrul Centrului de Cercetare în Gastroenterologie şi Hepatologie (CCGH) oferă studentilor, medicilor rezidenţi si doctoranzilor posibilitatea instruirii la un inalt nivel academic. Preocuparea permanentă a membrilor departamentului este de a gasi, prin intermediul cercetarilor vizând nivelul molecular, rezolvarea unor probleme cu care se confrunta medicina actuală. De asemenea, pe lângă oferta educaţională şi implicarea în cercetare, Departamentul de Genetică Moleculară, prin laboratoarele sale, efectuează o gamă variată de investigaţii asupra acizilor nucleici.


Colaborarea permanentă cu Departamentul de Gastroenterologie din cadrul CCGH şi prin intermediul acestuia cu alte 5 departamente cu aceeasi specialitate s-a concretizat prin acceptarea spre finanţare a peste 10 proiecte de cercetare axate pe evaluarea patologiei maligne din sfera digestivă. Pe lângă achiziţionarea unor sisteme moderne de analiză a acizilor nucleici aceste proiecte au permis atât specializarea membrilor departamentului în centre de cercetare importante în Europa cât şi demararea unui amplu proces de recoltare de probe biologice în vederea constituirii unei banci de ADN si ARN.


 


Gene studiate (mutaţii&expresie genică):

 

ABL1

 

 

YWHAZ

 

 

P53

 

 

 

ANKRD17

 

 

EXO1

 

 

MLH1

 

 

MLH3

 

MSH2

 

 

MSH3

 

 

MSH4

 

 

MSH5

 

 

MSH6

 

 

HPRT1

 

CNR1

 

 


Echipamente utilizate:


  • Sistem automat de secvențiere Beckman Coulter CEQ 8000


Sistemul automat de secvenţiere a fost achiziţionat în anul 2008 ca urmare a finanţării proiectului cu titlul PI/Capacităţi/Modul I: Platforma Interdisciplinara de Cercetare pentru Tehnologii Imagistice Microendoscopice Avansate. Sistemul dispune de 8 capilare de 33 şi 50 cm utilizând 4 coloranti diferiti, cate unul pentru fiecare bază. Acesta detectează cu o fotodioda lungimea de unda indusă de 2 diode laser prin 4 filtre. Sistemul de operare contine functii multiple pentru analiza ADN si pentru simplificarea analizei si interpretarii datelor. Precizia functiei pentru colectarea datelor de aproximativ 98%.

Functia de secventiere prin alinierea automata a secventelor permite detectia mutatiilor, deletiilor si ambiguitatilor precum şi detectie automata a heterozigotilor. Functia pentru fragmente permite identificarea automata a alelelor (±1 baza la 400 de baze si ±2 baze la 600 de baze) cu scor SNP, instabilitate microsateliti (MSI), pierderea stării de heterozigozitate (LOH). Randamentul electroforezei este de 700bp / 45 min, 20 SNP / 15 min.

  • Sistemul Real-Time PCR - RotorGene-Corbett 6200 HRM

Termociclerul a fost achiziţionat în anul 2006 din fondurile alocate proiectului CEEX 1-2005 - Bazele moleculare ale cancerului colorectal: de la prevenţie la tratament (BM-COL), fiind up-gradat cu unitatea HRM în anul 2008. Unitatea HRM caracterizează ampliconii pe baza parametrilor de disociere (melting) printr-o tehnică similară analizei curbelor de topire dar oferind mult mai multe informaţii şi având numeroase aplicaţii. Ampliconii pot fi discriminaţi pe baza secvenţei, lungimii, conţinutului în GC sau complementarităţii între catene, ajungându-se la detectarea schimbării unei singure baze. Un avantaj suplimentar este conferit de posibilitatea detecţiei şi analizării unor secvenţe necunoscute anterior sau a unor variaţii complexe. În cadrul laboratoarelor noastre sistemul este utilizat pentru evaluarea expresiei genice în diferite patologii, genotipare şi detecţia agenţilor patogeni. De asemenea Real-Time PCR termociclerul poate fi folosit pentru detectarea gradului de metilare ADN, scanare genică şi cercetări asupra miARN.

  • Extractor automat  - Maxwell® 16 & Biofotometru Eppendorf


Pentru că un pas important în prelucrarea iniţială a probelor este reprezentat de procesul de extracţie şi purificare a acizilor nucleici departamentul nostru a achizitionat extractorul complet automat Maxwell® 16 – Promega. Echipamentul este prevazut cu afisaj digital pentru prezentarea protocoalelor de lucru si a desfasurarii parametrilor programati. Este posibilă izolarea ADN, ARN si proteine din orice tip de proba (sange, tesut) si orice tip de specie (animal, vegetal, bacterian).

Produsul obtinut are o concentratie si puritate ridicată putând fi folosit direct in aplicatii de PCR, Multiplexing si digestie enzimatica. Acest instrument poate procesa până la 16 probe în 45 minute, beneficiind de evitarea variabilităţii induse de prelucrarea manuală precum şi de reducerea costurilor prin diminuarea volumului reactivilor utilizati. Pentru evaluarea concentraţie şi purităţii ADN/ARN în departamentul nostru este utilizat spectrofotometrul Eppendorf Biophotometer cuplat cu unitatea optică Hellma TrayCell fiind astfel posibilă măsurarea în volume de 0,7 până la 5 µl probă.

  • Omogenizatoare de ţesut Mikro-dismembrator (Sartorius) & Heidolph Silent Crusher S


Având în vedere că analiza completă a acizilor nucleici implică, în multe cazuri, o etapă iniţială de omogenizare Departamentul de Genetică Moleculară dispune de o moară cu bile – Mikro-dismembrator (Sartorius) şi un omogenizator Heidolph Silent Crusher S. Aceste sisteme permit omogenizarea rapidă a probelor în condiţiile reducerii riscului degradării ADN, ARN şi proteinelor. În plus este evitată utilizarea unor enzime, metodă utilizată frecvent în liza celulară.
  • Sistem de fotodocumentare G:Box Chemi HR (Syngene)


Caracteristici:

- Capacitate de evaluare a greutăţii moleculare, a densităţii optice şi a intensităţii proteinelor şi a acizilor nucleici

- Capacitate de detecţie a probelor fluorescente, chemiluminscente sau cromogenice

- Transiluminare şi epi-iluminare atât pentru utilizarea luminii albe cât şi ultraviolete (UV)

- Capacitate de analiză cantitativă a imaginii de la nivel de picomol la femtomol pe geluri şi bloturi cu senzitivitate egală cu autoradiografia

- Camera:

       - full frame CCD, 1.4 megapixeli

       - răcire în circuit închis, până la 25°C sub temperatura camerei

       - lentile: zoom 6x, 12.5-75mm, f 1.2 - f 16